Sekwencje insercyjne i plazmidy bakterii mlekowych w generowaniu różnorodności biologicznej bakterii Bacillus subtilis
9
14
0
Abstract:
Evaluations

Nobody evaluated this document yet.

Login to evaluate.

Bakterie mlekowe należące do rodzaju Lactococcus zawierają wiele plazmidów replikujących według dwóch ogólnie znanych mechanizmów, t.j. mechanizmu toczącego się koła (RCR) (ang. rolling circle replication) i typu theta (ang. theta replication). Plazmidy RCR mają zwykle niewielkie rozmiary, do 2-3 tysięcy par zasad (t.p.z.) i zazwyczaj są kryptyczne. Plazmidy typu theta należą do najczęściej spotykanych, mają wielkość od kilku do kilkudziesięciu t.p.z. i kodują wiele ważnych technologicznie funkcji bakterii mlekowych, takich jak fermentacja laktozy, aktywność proteinazowa, mechanizmy fagooporności, produkcja bakteriocyn, produkcja zewnątrzkomórkowych polisacharydów, oporność na jony metali ciężkich i antybiotyki oraz wiele innych cech. Występują zwykle w niewielkiej liczbie kopii na komórkę, ale są stabilne zarówno strukturalnie jak i segregacyjnie. Cechą charakterystyczną większości plazmidów typu theta bakterii Laciococcus jest fakt występowania w ich strukturze wielu różnych sekwencji insercyjnych i transpozonów, które są przyczyną dużej zmienności genetycznej tych bakterii. Sekwencje insercyjne występują również w DNA chromosomalnym bakterii z rodzaju Lactococcus, a ich obecność sprawia, że mogą powodować znaczne przegrupowania w obrębie chromosomu, polegające na inwersji lub delecji dużych fragmentów DNA. Sekwencje insercyjne są zatem aktywnym czynnikiem powodującym różnorodne mutacje i w istotny sposób wpływają na zmienność biologiczną szczepów, wyrażającą się znacznymi różnicami w aktywności tych samych szlaków metabolicznych (np. metabolizm cytrynianu i laktozy) bądź też pojawianiem się całkowicie nowych właściwości (np. produkcja bakteriocyn czy oporność na jony metali ciężkich). Z drugiej strony, bakterie mlekowe z rodzaju Lactococcus mające status organizmów typu GRAS (ang. generally regarded as safe) mogą być wykorzystywane bez ograniczeń jako narzędzia do otrzymywania fermentowanych produktów spożywczych lub też jako dodatki do żywności. Z tego powodu DNA pochodzące z tych bakterii, zarówno chromosomowe jak i plazmidowe, również może być wykorzystywane do modyfikacji innych drobnoustrojów na drodze transformacji. Właściwości sekwencji insercyjnych tych bakterii polegające na wywoływaniu mutacji insercyjnych wydają się zatem bardzo interesującym narzędziem do prób generowania zmienności genetycznej innych gramdodatnich bakterii, np. z rodzaju Bacittus. Celem prezentowanej pracy było sprawdzenie czy DNA plazmidowe i „czyste" DNA sekwencji insercyjnych izolowane z bakterii mlekowych może wywoływać mutacje u bakterii Eacillus subtilis. W tym celu zastosowano technikę transformacji bakterii Bacillus subtilis za pomocą obydwu rodzajów DNA bakterii mlekowych oraz opracowano sposoby wyodrębniania mutantów o zmienionych właściwościach biochemicznych i fizjologicznych. W eksperymentach transformacji Bacillus subtilis z wykorzystaniem plazmidów bakterii mlekowych otrzymano klony o zmienionych cechach morfologicznych i niezdolne do procesu sporulacji. Ponadto szczepy te charakteryzowały się znaczną aktywnością β-galaktozydazy (niewykrywalną u szczepu wyjściowego) oraz opornością na kanamycynę (50 μg*cm-3) i wysokie stężenie jonów kadmu (500 μM). Porównanie wydajności syntezy biomasy szczepu wyjściowego i otrzymanych klonów w pożywce zawierającej laktozę jako źródło węgla wykazało, że szczepy te aktywnie metabotizują laktozę, a ponadto komórki nie przetrwatnikują i nie ulegają autolizie. Otrzymane mutanty wydają się zatem być dobrymi gospodarzami dla rekombinowanych genetycznie plazmidów warunkujących, np. wysoką produkcję enzymów zewnątrzkomórkowych takich jak amylazy, glukanazy czy proteazy. Do transformacji Bacillus subtilis wykorzystano również zmodyfikowany duży plazmid bakterii Lactococcus laclis ssp. lactis var. diacetylactis 239. Modyfikacja ta polegała na jego zmniejszeniu. W wyniku transformacji Bacillus subtilis PSL1, otrzymano szereg transformantów opornych na kanamycynę, a jeden z nich zawierał autonomiczny plazmid, który nazwano pLD239. Udało się zatem przenieść duży plazmid bakterii mlekowych do komórek Bacillus subtilis i uzyskać ekspresję genu oporności na kanamycynę. Określono wielkość tego plazmidu na 26,7 tysięcy par zasad i stwierdzono, że enzym restrykcyjny Sali generuje 4 fragmenty oznaczone F1 - F4 o długości odpowiednio 1,9; 3,8; 7,0 i 14,0 t.p.z. Fragmenty te sklonowano w plazmidzie pUC19, w komórkach Escherichia coli JM101, otrzymując rekombinowane plazmidy pUC19:F1-pLD239, pUC19:F2-pLD239, pUC19:F3-pLD239, PUC19:F4-pLD239. Stwierdzono również, że fragment F2 jest odpowiedzialny za oporność na kanamycynę, a fragment F4 zawiera minimainy replikon funkcjonujący u Bacillus subtilis. Fragmenty F3 oraz F4 plazmidu pLD239 zawierały najprawdopodobniej sekwencje insercyjne gdyż transformacja komórek Bacillus subtilis rekombinowanymi plazmidami pUC19:F3-pLD239 i pUC19:F4-pLD239 prowadziła do otrzymywania mutantów o zmienionych cechach biochemicznych oraz morfologicznych co mogło być wynikiem mutacji insercyjnych. Zastosowano technikę PCR do wyodrębniania sekwencji insercyjnych ISS1 i IS904 z różnych szczepów bakterii Lactococcus lactis, a otrzymane DNA obu sekwencji wykorzystane zostało do transformacji komórek Bacillus subtilis metodą elektroporacji, w wyniku, której izolowano mutanty insercyjne. Ze względu na to, że „czyste" sekwencje insercyjne nie kodują żadnych łatwo wykrywanych cech fenoptypowych to do detekcji mutantów insercyjnych zastosowano różne czynniki selekcyjne, gdyż pod wpływem wprowadzonej sekwencji insercyjnej, komórki bakterii mogą nabywać cechę oporności na kanamycynę i inne antybiotyki, oporność na jony kadmu bądź też detergenty, takie jak np. Tergitol. Otrzymane tą drogą mutanty miary zmienioną morfologię komórek, nie przetrwalnikowary i wytwarzały różnorodne pigmenty oraz charakteryzowały się zmienioną morfologią kolonii. Wykazano, że badane sekwencje insercyjne indukowały u bakterii Bacillus subtilis produkcję substancji o działaniu antybiotycznym w stosunku do innych gatunków bakterii, drożdży i grzybów nitkowatych, co najprawdopodobniej wiązało się z aktywacją genów odpowiedzialnych za biosyntezę bakteriocyn i/lub biosurfaktantów. Niektóre szczepy mutantów insercyjnych charakteryzowały się zwiększonym wydzielaniem specyficznych białek zewnątrzkomórkowych, co może być wykorzystane do skonstruowania wektorów sekrecyjnych w oparciu o sygnały genetyczne sterujące produkcją i wydzielaniem tych białek (sekwencja promotorowa, miejsce wiązania rybosomów, sekwencja peptydu liderowego). Stwierdzono również, że wprowadzenie sekwencji insercyjnej ISS1 i IS904 do komórek Bacillus subtilis może powodować efekt plejotropowy polegający na znacznym ograniczeniu liczby metabolizowanych substratów. Otrzymano mutanty, które metabolizowaly jedynie glukozę i fruktozę spośród 24 substratów węglowodanowych metabolizowanych przez szczep wyjściowy. Obecność sekwencji insercyjnej lSSl i IS904 w komórkach Bacillus subtilis powodowała znaczną niestabilność otrzymanych mutantów, które często podlegały dalszym samorzutnym zmianom cech fizjologicznych i biochemicznych zachodzących prawdopodobnie w wyniku kolejnych transpozycji sekwencji insercyjnej. Zmiany te można było indukować za pomocą niskiej temperatury czy też różnych czynników selekcyjnych. Wykazano że zastosowanie mineralnej pożywki minimalnej Spizizena ze skrobią jako jedynym źródłem węgla do selekcji szczepów, pozwoliło na otrzymanie ze szczepu Bacillus subtilis BGSC1 A2S9/IS904, który asymilował jedynie glukozę i fruktozę, nowych mutantów zdolnych do rozkładu skrobi o znacznie zwiększonej aktywności amylolitycznej w porównaniu do szczepu wyjściowego. Przykład ten wskazuje, że zastosowanie do selekcji niemetabolizowanego substratu przez mutanta Bacillus subtilis BGSC1A289/IS904 prowadzi do aktywacji genów uczestniczących w asymilacji tego substratu. Taka metoda selekcji wydaje się zatem być bardzo pomocna do otrzymywania mutantów aktywnie metabolizujących inne substraty. Niestabilność mutantów insercyjnych polegała również na zmianie barwy kolonii z żółtej na pomarańczową lub czerwoną, z pomarańczowej na żółtą, z gładkiej na szorstką i odwrotnie. Obserwowano również zmiany polegające na przywróceniu funkcji ruchu komórki powstałe prawdopodobnie poprzez odblokowanie mutacji odpowiedzialnej za syntezę rzęsek bakterii. Łatwość z jaką można wprowadzić sekwencje insercyjne do komórek Bacillus subtilts i różnorodność zmian genetycznych obserwowanych pod wpływem tych sekwencji sprawiają, że technika ta może stanowić bardzo cenne narzędzie do badania funkcji genów, zwiększania aktywności różnych szlaków metabolicznych jak i indukcji ekspresji genów nieaktywnych u szczepu wyjściowego np. z powodu braku aktywnego promotora. Mutanty otrzymane tą metodą mogą być wykorzystane bezpośrednio w różnych procesach biotechnologicznych takich jak np. biosynteza enzymów zewnątrzkomórkowych lub substancji antybiotycznych czy też pigmentów komórkowych. Mutanty o pożądanych cechach technologicznych takich jak brak sporulacji, ograniczona lizą komórek, wykorzystywanie tanich odpadowych substratów węglowodanowych, wysoka wydajność syntezy biomasy czy też aktywna sekrecja białek zewnątrzkomórkowych mogą być wykorzystywane jako komórki gospodarza dla procesów biotechnologicznych wykorzystujących technikę rekombinacji DNA. Ponadto analiza genetyczna otrzymanych mutantów może prowadzić do wyjaśnienia mechanizmów regulacji aktywności genów, oznaczenia właściwości genów o dotychczas nieznanej funkcji, a także przyczynić się do poznania interakcji pomiędzy różnymi genami.
Cookie:
The our website use cookies to provide you with top-quality services, which are personalised to individual needs. Using the website without changing the setting of cookies is that they will be stored on your end device. You can at any time make changes to the settings for cookies. Close